應(yīng)用簡介

熒光定量PCR是檢測生物樣品中RNA含量的zui普遍的方法，通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。目前主要使用Sybrgreen和taqman法對RNA含量進行檢測。
技術(shù)原理

1、SYBRGREENI是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出熒光；從DNA雙鏈上釋放出來時，熒光信號急劇減弱。因此，在一個體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBRGreen熒光染料定量PCR的基本過程是：1、開始反應(yīng)，當(dāng)SYBRGreen染料與DNA雙鏈結(jié)合時發(fā)出熒光。2、DNA變性時，SYBRGreen染料釋放出來，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBRGreen染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測到熒光的凈增量加大。

2、TaqMan探針法核心是探針分子，TaqMan探針是單鏈DNA，5’端偶聯(lián)發(fā)光基團，3’端偶聯(lián)淬滅基團，游離的完整探針是檢測不到熒光信號的，發(fā)光基團發(fā)出的熒光會被淬滅基團吸收淬滅，探針被水解，發(fā)光基團和淬滅基團遠離就可以檢測到熒光信號。反應(yīng)開始時，模板鏈經(jīng)熱變性解鏈形成單鏈，TaqMan探針優(yōu)先跟模板鏈退火，引物隨后退火到模板上，之后進行鏈的延伸，延伸過程中Taq酶發(fā)揮5’-3’外切酶活性，遇到探針會從5’端逐個堿基切除探針，發(fā)光基團會跟淬滅基團分開，因此熒光檢測系統(tǒng)可以接收到熒光信號，每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，熒光信號的累積和PCR產(chǎn)物形成是同步的。

TaqMan探針法的特異性除了由引物提供，更由探針分子保證，因其退火溫度更高，所以TaqMan探針法特異性更好，在一個反應(yīng)體系中加入多條探針，可以做多個基因同時檢測。
實驗方法
TaqMan探針法

技術(shù)總結(jié)

一、引物設(shè)計

1、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段；

2、Taqman探針技術(shù)要求片段長度在50bp-150bp；

3、避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)。避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對；

4、典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列du特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性，較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。Tm值在55-65℃，GC含量在40%-60%；

5、引物之間的Tm值相差避免超過2°C；

6、引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基；

7、為避免基因組的擴增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯子；

8、探針位置盡可能地靠近上游引物；

9、探針的5'端應(yīng)避免使用堿基G，引物的3’端避免使用堿基A。探針長度通常在25~35bp，Tm值在65~70°C,通常比引物Tm高5~10°C，GC含量在40%~70%；

10、整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量；

11、為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計好的序列在Blast中核實一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針。

二、熱啟動

熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。 

三、鎂離子濃度

鎂離子影響PCR的多個方面，如：對DNA聚合酶的活性的影響進而影響產(chǎn)量;對引物退火的影響，進而影響特異性。若dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，則降低了酶活性所需要的游離鎮(zhèn)離子的量。

四、模板質(zhì)量

模板的質(zhì)量會影響產(chǎn)量。DNA樣品中可能有多種污染物會抑制PCR。

五、防止殘余污染

1、PCR易受污染的影響，因為它是一種敏感的擴增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴增。當(dāng)前一次擴增產(chǎn)物用來進行新的擴增反應(yīng)時，會發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其它樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源(非殘余污染)。

2、可以在PCR過程中使用良好的實驗步驟減少殘余污染。為PCR樣品配制和擴增后分析設(shè)計隔離的區(qū)域，在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換手套。總是使用不含有模板的陰性對照檢測污染。使用預(yù)先混合的反應(yīng)成份，而不是每個反應(yīng)的每個試劑單獨加入。