北林：NMT發(fā)現(xiàn)NO促Pb吸收并誘導(dǎo)Ca2+流紊亂 為NO增強(qiáng)Pb毒性

基本信息

主題：NMT發(fā)現(xiàn)NO促Pb吸收并誘導(dǎo)Ca²⁺流紊亂 為NO增強(qiáng)Pb毒性的機(jī)制研究提供證據(jù)

期刊：Plants

影響因子：2.632（2019年）

研究使用平臺：NMT重金屬創(chuàng)新平臺

標(biāo)題：Nitric Oxide Enhances Cytotoxicity of Lead by Modulating the Generation of Reactive Oxygen Species and Is Involved in the Regulation of Pb²⁺ and Ca²⁺ Fluxes in Tobacco BY-2 Cells

作者：北京林業(yè)大學(xué)荊艷萍、武佳葉、張越

檢測離子/分子指標(biāo)

Pb²⁺、Ca²⁺

檢測樣品

4日齡BY-2細(xì)胞

鉛是已知對動植物都有毒害作用的重金屬。據(jù)報道，一氧化氮（NO）參與植物對不同重金屬脅迫的響應(yīng)。本研究分析了外源和內(nèi)源NO在鉛誘導(dǎo)煙草BY-2細(xì)胞毒性中的作用，使用非損傷微測技術(shù)（NMT）重點(diǎn)研究了NO在活性氧（ROS）生成以及Pb²⁺和Ca²⁺流速中的作用。Pb處理誘導(dǎo)BY-2細(xì)胞死亡并迅速產(chǎn)生NO和ROS，而NO爆發(fā)發(fā)生早于ROS積累。2-4-carboxyphenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide（cPTIO）消除NO導(dǎo)致ROS減少，硝普鈉（SNP）補(bǔ)充NO導(dǎo)致ROS積累增加。此外，外源NO的加入刺激了Pb²⁺的內(nèi)流，從而促進(jìn)了細(xì)胞對Pb的吸收，加重了Pb對細(xì)胞的毒性，而去除內(nèi)源性NO則產(chǎn)生了相反的作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，外源性和內(nèi)源性NO均增強(qiáng)Pb誘導(dǎo)的Ca²⁺外排和鈣穩(wěn)態(tài)紊亂。這些結(jié)果表明，外源和內(nèi)源性NO通過促進(jìn)Pb²⁺的內(nèi)流和積累，干擾鈣穩(wěn)態(tài)，在Pb脅迫誘導(dǎo)的BY-2細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

離子/分子流實(shí)驗處理

1、250 μM Pb(NO₃)₂處理BY-2細(xì)胞10 h

2、250 μM Pb(NO₃)₂+0.5 μM SNP處理BY-2細(xì)胞10 h

3、250 μM Pb(NO₃)₂+100 μM cPTIO處理BY-2細(xì)胞10 h

4、0.5 μM SNP、100 μM cPTIO實(shí)時處理

本研究用250 μM Pb (NO₃)₂處理4日齡煙草BY-2細(xì)胞，立即用NMT測定Pb²⁺流速。250 μM Pb (NO₃)₂處理后，Pb²⁺內(nèi)流速率恒定，平均值為70.40±2.70 pmol cm^-2·s^-1（圖1A）。添加0.5 μM SNP后，Pb²⁺內(nèi)流顯著增加，達(dá)到160.56±32.83 pmol cm^-2·s^-1，顯著增加128.06%。與單獨(dú)Pb處理相比，100 μM cPTIO處理顯著抑制了Pb²⁺的內(nèi)流，甚至出現(xiàn)6.75±0.85 pmol cm^-2·s^-1的Pb²⁺凈外排（圖1A, B）。這些結(jié)果表明，在短時間內(nèi)，SNP或cPTIO的存在顯著改變了Pb (NO₃)₂處理下的的Pb²⁺流速。

圖1. Pb脅迫下施用SNP和cPTIO前后NO對煙草BY-2細(xì)胞Pb²⁺流速的影響。正值代表Pb²⁺外排，負(fù)值代表Pb²⁺內(nèi)流。

圖2. 不同處理10 h后NO對煙草BY-2細(xì)胞中Pb²⁺流速的影響。正值代表Pb²⁺外排，負(fù)值代表Pb²⁺內(nèi)流。

圖3. 不同處理10 h后NO對煙草BY-2細(xì)胞中Ca²⁺流速的影響。正值代表Ca²⁺外排，負(fù)值代表Ca²⁺內(nèi)流。

如圖4所示，Pb脅迫誘導(dǎo)了Pb²⁺的內(nèi)流以及ROS和NO的產(chǎn)生。Pb脅迫誘導(dǎo)的外源和內(nèi)源NO作用于ROS上游，促進(jìn)煙草BY-2細(xì)胞內(nèi)ROS的積累和隨后的細(xì)胞死亡。外源NO和內(nèi)源NO均能增強(qiáng)煙草BY-2細(xì)胞對Pb的毒性，其機(jī)制可能與NO能刺激Pb²⁺內(nèi)流，從而促進(jìn)Pb的吸收，加重Pb誘導(dǎo)的BY-2細(xì)胞Ca²⁺穩(wěn)態(tài)失調(diào)有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)會使大家對植物細(xì)胞中NO潛在的Pb細(xì)胞毒性機(jī)制有了更好的認(rèn)識。

測試液

Pb²⁺：0.1 mM KCl, 0.05 mM CaCl₂, 0.05mM MgCl₂, 0.5 mM NaCl, 0.25 mM Pb(NO₃)₂, 0.3 mM MES, 3% sucrose, pH 5.8

Ca²⁺：0.1 mM KCl, 0.05 mM CaCl₂, 0.05 mM MgCl₂, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 3% sucrose, pH 5.8

儀器采購信息

據(jù)中關(guān)村NMT產(chǎn)業(yè)聯(lián)盟了解，北京地區(qū)的北京林業(yè)大學(xué)于2009年采購了美國揚(yáng)格公司的非損傷微測系統(tǒng)